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在針對新樣品進行細菌內(nèi)毒素檢測的過程中,面對有色樣品時,許多用戶往往認為濁度檢測試劑是唯-一的選擇,但事實真的如此嗎?
一、認識你的敵人:深入了解細菌內(nèi)毒素
細菌內(nèi)毒素?zé)o疑是令人頭疼的存在,作為革蘭氏陰性細菌細胞壁內(nèi)普遍存在的非感染性微粒,它能夠觸發(fā)免疫反應(yīng),引發(fā)發(fā)熱、炎癥乃至膿毒性休克等嚴重后果,極-端情況下甚至可致命。鑒于此,藥品和保健品若遭內(nèi)毒素污染,將帶來極大的安全隱患。因此,實施嚴格的內(nèi)部細菌內(nèi)毒素檢測計劃,對于確保這些產(chǎn)品以及醫(yī)療器械免受內(nèi)毒素污染至關(guān)重要。BET(細菌內(nèi)毒素檢測)不僅是一項監(jiān)管要求,更是維護公眾健康不-可-或-缺的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
圖1. 革蘭氏陰性細菌細胞內(nèi)毒素結(jié)構(gòu)示意圖
二、出于對顏色的好奇:顯色法檢測背后的科學(xué)
您是否曾好奇動力學(xué)顯色試驗的奧秘?這項藥典技術(shù)背后隱藏著令人驚嘆的科學(xué)原理。
圖 2. LAL級聯(lián)機制描述和動力學(xué)顯色試驗的方法原理
顯色試驗之所以神奇,在于其結(jié)合了簡便性、線性度和準確性。試驗中,除了利用級聯(lián)機制中的LAL酶(包括因子C、因子B和凝血酶原)外,還引入了顯色底物這一關(guān)鍵元素。最初,顯色底物呈無色狀態(tài),但當(dāng)它與被細菌內(nèi)毒素活化的凝血酶相遇時,一場化學(xué)反應(yīng)悄然發(fā)生。
圖3.ACC 顯色試劑中使用的顯色底物示例
凝血酶會裂解精氨酸-發(fā)色基質(zhì)中的CO鍵,釋放出一種叫做對硝基苯胺(pNA)的發(fā)色團——一種能吸收光(最大吸收值接近405nm的可見光)的微粒,從而引發(fā)溶液顏色變黃,這一變化肉眼可見。
為了精確測量這一顏色變化,科學(xué)家們采用吸收光分光光度計進行定量分析。根據(jù)以往經(jīng)驗,顏色的深淺程度與樣品中細菌內(nèi)毒素的含量成正比。因此,通過顯色試驗,我們能夠快速、準確地評估樣品中的細菌內(nèi)毒素水平。
圖4. 在405nm 波長處測量的吸光度與內(nèi)毒素濃度定義的典型示意圖
自20世紀90年代以來,顯色檢測技術(shù)憑借其獨-特的優(yōu)勢,改變了細菌內(nèi)毒素檢測領(lǐng)域的游戲規(guī)則,成為生物學(xué)與比色法完-美結(jié)合的典-范。
三、重組顯色測試如何進一步提高產(chǎn)出?
重組顯色檢測法通過引入幾項突破性功能,將其優(yōu)勢提升到了新的高度。
圖5. 一個典型的微孔板顯示了動力學(xué)顯色試驗的顏色變化
首先,重組級聯(lián)試劑(rCR)PyroSmart NextGen®采用了重組因子C、重組因子B和重組凝固酶原,這些因子是從美洲鱟(Limulus polyphemus)中基因克隆并表達的級聯(lián)酶制劑,這一變革使得檢測過程中無需再使用動物源成分,從而實現(xiàn)了更加環(huán)保的檢測方式。
圖6. 重組級聯(lián)試劑的作用機制
此外,PyroSmart NextGen®試劑中不含動物源LAL試劑中的原生成分因子G,這一改進避免了因(1→3)-β-D-葡聚糖(一種常見污染物)引發(fā)的共敏性問題,進而顯著降低了檢測結(jié)果超范圍的風(fēng)險。
圖7. 含有和不含(1→3)-β-D-葡聚糖加標的兩個RSE標準系列的起始時間(秒)的線性回歸
圖8.使用六種不同批次的PyroSmart NextGen®的RSE標準曲線系列,顯示出很強的批次一致性
尤為重要的是,該試劑確保了批次間結(jié)果的高度可重復(fù)性,這一特性為質(zhì)量控制實驗室實現(xiàn)標準化和現(xiàn)代化,特別是推動移液自動化進程,奠定了堅實的基礎(chǔ)。
在ACC(Associates Of Cape Cod),PyroSmart NextGen®于相同的cGMP條件下生產(chǎn),保證了其質(zhì)量和性能的一致性和可靠性。與此同時,rCR與我們已獲得FDA許可的LAL試劑一樣,均在通過ISO 14385認證的工廠生產(chǎn),這不僅確保了檢測結(jié)果的可靠與可重復(fù),也使rCR成為細菌內(nèi)毒素檢測領(lǐng)域中一個值得信賴且可持續(xù)的解決方案。
四、揭開秘密:有色樣品檢測背后的數(shù)據(jù)
有一種常見的誤解,認為顯色法在處理有色樣品時會遇到困難。然而,通過實際數(shù)據(jù)和經(jīng)驗證明,當(dāng)方法適用性良好時,顯色法,包括重組顯色法,能夠高效且準確地檢測有色樣品。根據(jù)USP<85>和<1085>的規(guī)定,對所有樣品進行方法適用性測試是常規(guī)測試前的必要步驟,這有助于確定適當(dāng)?shù)臋z測方法,并評估檢測設(shè)置(如試劑類型、方法類型和儀器)與樣品的兼容性。
趣聞1:大多數(shù)藥物樣本類型都會干擾BET。
趣聞2:絕大多數(shù)樣品干擾都可以通過簡單的BET檢查用水稀釋[如LAL試劑水(LRW)]來克服。
有色樣品也不例外。除了固有的顏色外,它們通常還可能含有干擾測試的成分。根據(jù)我們的經(jīng)驗,用LRW(如無熱原水)稀釋極有可能在一個簡單的步驟中解決光學(xué)和化學(xué)干擾這問題。
除了稀釋外,還有另一個非常有價值的工具:儀器和軟件。先進分光光度法的出現(xiàn)大大緩解了人們對測試有色樣品的擔(dān)憂。基線設(shè)置和歸零在此過程中起著關(guān)鍵作用。例如,在Pyros Kinetix® Flex試管閱讀器中,每個孔都要單獨計時和評估,它涉及記錄樣品的初始吸光度。這基本上是在任何反應(yīng)發(fā)生之前通過樣品的固有顏色來測量吸光度。然后將此基線讀數(shù)用作所有一系列稀釋中(不超過最大有效稀釋度)后續(xù)10秒測量的參考點,從而可以準確捕獲真實的顏色強度增加,而與樣品本身的顏色無關(guān)。
Pyros Kinetix® Flex由Pyros® eXpress軟件提供支持,該軟件內(nèi)置了每孔檢索原始數(shù)據(jù)的規(guī)范。在初始歸零期間,在405nm波長處吸收強烈顏色的樣品會產(chǎn)生較低的透射率值,因此會在軟件中標記為超出范圍,提醒操作員采取進一步措施。
五、案例研究:顯色法在有色樣品測試中的實際應(yīng)用
那么,這一切是如何實現(xiàn)的呢?讓我們來看看MIC注射劑的可比性測試——一種維生素混合注射劑,由主要化合物(蛋氨酸、肌醇、膽堿)和其他成分(如維生素B12)組成。根據(jù)各成分的濃度,最終制備可能如下所示:
圖9. MIC注射液的系列稀釋
LRW中的稀釋系列(MVD=14000)
加入BET水后,有色背景會被進一步稀釋
使用動態(tài)濁度法(KTA)測試MIC注射液所有測試系列稀釋的陽性對照和陽性樣品對照的數(shù)據(jù)收集圖(加標濃度為0.5 EU/mL):
圖10. 在Pyros Kinetix® Flex管式讀數(shù)器中進行動態(tài)濁度測試時,對添加了0.5EU/mL的MIC注射稀釋液的范圍進行的數(shù)據(jù)采集圖
解釋:原液-未經(jīng)測試。濃縮的MIC注射液呈深黃色,能非特異性地吸收整個可見光光譜。
圖11. 使用動態(tài)顯色法在Pyros Kinetix® Flex管式閱讀器上進行檢測時,對添加0.5EU/mL的注射稀釋液范圍所繪制的數(shù)據(jù)采集圖
(1)1:10的PPC - 固有顏色對于濁度測試來說仍然太深,仍然會非特異性地吸收通過的光,Pyros® eXpress會在測試開始60秒后通知用戶透射率規(guī)格未達標。
(2)1:100的PPC - 在0到800秒之間會有殘余的光學(xué)干擾,然后會被與細菌內(nèi)毒素反應(yīng)有關(guān)的濁度變化所克服。
(3)1:1000的PPC - 無光學(xué)干擾。
(4)1:10000的PPC - 無光學(xué)干擾。
總之,濁度測試與顯色測試觀察到的光學(xué)干擾程度相同。在 1:100時觀察到殘余干擾。用兩種LAL方法檢測時,1:1000稀釋液都沒有光學(xué)和化學(xué)干擾,因此可以選擇1:1000稀釋液進行進一步檢測和驗證。
使用PyroSmart NextGen®進行了其他測試,將MIC注射液按1:500稀釋,足以克服光學(xué)干擾。
六、專家意見:質(zhì)量控制技術(shù)人員參與其中
在制藥質(zhì)量控制領(lǐng)域,領(lǐng)-先的科學(xué)家和管理人員已成功驗證了有色樣品的動態(tài)顯色法測試。他們的實踐表明,根據(jù)具體情況,測試策略可靈活選擇:一些團隊直接采用顯色技術(shù),看重其寬動態(tài)范圍的優(yōu)勢;有的則從濁度技術(shù)入手,逐步過渡到顯色技術(shù);特別是對新產(chǎn)品的內(nèi)部測試,有些企業(yè)直接應(yīng)用重組顯色法來檢測有色樣品。
除了卓-越的分析性能,光度測定技術(shù)還積極響應(yīng)3R原則(減少、替代、回收),顯著降低了試劑中動物源性原料的使用,而重組試劑更是摒棄了這類原料。
七、關(guān)于稀釋:獲得準確結(jié)果的關(guān)鍵
在檢測過程中,正確的稀釋技術(shù)是確保有色及無色樣品獲得準確結(jié)果的關(guān)鍵,有助于消除對顯色檢測能力的誤解。通過深入理解反應(yīng)成分,運用合適的儀器和軟件平臺,并有效利用其內(nèi)置功能來標識不合格樣品,用戶能在檢測初期迅速識別問題。經(jīng)過適當(dāng)?shù)姆椒ㄩ_發(fā),顯色技術(shù)在有色樣品檢測上的表現(xiàn)與濁度技術(shù)相當(dāng),甚至在低稀釋度下,重組顯色法也能驗證結(jié)果的有效性,根據(jù)專家意見、經(jīng)驗數(shù)據(jù)和對動物福利的倫理要求,證明重組顯色法不受樣品顏色影響的穩(wěn)健性、可持續(xù)性和可靠性。
這些先進方法的采用,標志著藥品質(zhì)量控制向更加標準化和現(xiàn)代化的程序邁進,不僅提升了檢測效率,還確保了醫(yī)療產(chǎn)品的安全性和有效性。