雜質(zhì)測試的適當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)是分析測試的重要組成部分。本文概述了美國藥典（USP）規(guī)定的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)的各種要求，并詳細(xì)闡述了內(nèi)毒素與其他細(xì)胞成分不同的定義。

內(nèi)毒素或脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性菌外膜 （OM）外葉（OL）的組成部分。它是一種獨(dú)-特的分子，被后生動物免疫系統(tǒng)用作原核生物入侵的標(biāo)記，并作為多種革蘭氏陰性菌OM成分（包括磷脂和表面蛋白）中的單一成分出現(xiàn)。 

LPS根據(jù)USP參考標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量要求從其他雜質(zhì)中純化出來。  高度純化的材料被用作標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素 （RSE/CSE），它在歷-史-上一直用于分析定義內(nèi)毒素。在工業(yè)上，有些人希望為各種目的制備一種非純化的或“天然的標(biāo)準(zhǔn)品"，并將這些制劑稱為“天然內(nèi)毒素"。本文概述了美國藥典（USP）1規(guī)定的一些標(biāo)準(zhǔn)要求，并詳細(xì)闡述了內(nèi)毒素與其他細(xì)胞成分不同的定義。 

一、標(biāo)準(zhǔn)化

USP 40一般要求<11>的摘錄指出：

“美國藥典公約（USP標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或RS）提供的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是反映特定藥物和食品（原料藥、生物制劑、賦形劑、膳食補(bǔ)充劑、食品成分、雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、試劑和性能驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)品）的高度表征本。當(dāng)批準(zhǔn)適合用作USP或國家處方集 （NF） 中文件測試或化驗(yàn)的比較標(biāo)準(zhǔn)（即，作為專著組成部分）時，USP RS也在美國獲得官-方地位和法律認(rèn)可。

USP <11> 的“雜質(zhì)參考標(biāo)準(zhǔn)"部分指出：“雜質(zhì)參考標(biāo)準(zhǔn)可以作為純化的單一組分材料或作為多種雜質(zhì)的混合物出現(xiàn)。" 工業(yè)界要維持當(dāng)前的“內(nèi)毒素"標(biāo)準(zhǔn)（BET <85>），而不是“革蘭氏陰性細(xì)胞壁"標(biāo)準(zhǔn)，必須對其進(jìn)行純化和高度表征，否則它將成為“混合雜質(zhì)"標(biāo)準(zhǔn)，并被貼上這樣的標(biāo)簽。

圖1：分解成相關(guān)組成部分的內(nèi)毒素定義

二、內(nèi)毒素的定義

鑒于本文的簡短性質(zhì)，只能提供LPS定義的初步草圖（圖1）。主題將僅限于與內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)化相關(guān)的項(xiàng)目：

1. LPS生物合成；

2. 宿主反應(yīng)的相互特異性；

3. 革蘭氏陰性菌外膜的不對稱性；

4. 對比成分。

1. LPS 生物合成

內(nèi)毒素在自然界中并非隨機(jī)發(fā)生；它是細(xì)菌制造過程的產(chǎn)物，該過程涉及九個獨(dú)立的酶促事件，然后輸出到革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞表面。LPS中獨(dú)-特的糖包括核心糖、KDO（3脫氧-α-D-甘露醇辛酮酸糖）和O抗原部分中糖的獨(dú)-特排列，用于在表征各種革蘭氏陰性細(xì)菌食源性疾病暴發(fā)（血清分型）時區(qū)分細(xì)菌菌株。 

圖2：LPS獨(dú)-特的結(jié)構(gòu)定義3

獨(dú)-特的LPS結(jié)構(gòu)以及相關(guān)的糖殘留物和排列如圖2所示。用于“建構(gòu)"LPS的酶級聯(lián)，如細(xì)菌基因組中編碼的那樣，沒有顯示，但Wang和Quinn進(jìn)行了廣泛的詳細(xì)說明，并支持LPS是一個特定的功能單元。2

2.宿主反應(yīng)的相互特異性 

后生動物系統(tǒng)已經(jīng)通過其非常具體的反應(yīng)定義了內(nèi)毒素。然而，并非所有后生動物的反應(yīng)都是相同的。幾十年來，基于鱟的測試一直是支持藥物測試的有效分析替代品。哺乳動物反應(yīng)的特異性是極-端的。通過脂多糖結(jié)合蛋白（LBP）從聚集體中選擇（純化）LPS的單個分子，或者可能作為單體，其中已發(fā)現(xiàn)血清白蛋白可代替LBP。4分離后，LPS分子被轉(zhuǎn)移到位于TLR4中的MD-2，并引發(fā)跨膜信號事件。這大約是分子所能達(dá)到的“純化"程度。TLR4不僅對分子進(jìn)行測量，而且還根據(jù)亞分子部分的潛在差異發(fā)出響應(yīng)信號。

圖3：革蘭氏陰性菌的LPS激活宿主先天免疫反應(yīng)。Ryu等人研究了LBP-CD14介導(dǎo)的LPS轉(zhuǎn)移到TLR4-MD-2至單分子分辨率的動態(tài)中間體。5

斷言LPS本質(zhì)上是“未純化的"似乎是語義問題；它在其生物合成中以單一分子開始，在哺乳動物受體中作為單一分子結(jié)束。出于哺乳動物檢測的目的，它已通過當(dāng)前的分析方法盡可能地純化。請參閱圖3 中（規(guī)范的）哺乳動物檢測級聯(lián)的概述。6

3. 革蘭氏陰性菌外膜的不對稱性

從能量上講，革蘭氏陰性菌的作用是維持與革蘭氏陰性菌外膜相關(guān)的不對稱性。這保持了一個有效的屏障，防止疏水性“斑塊"的形成，疏水“斑塊"可能允許不需要的物質(zhì)（即抗生素）不加選擇地通過。這是治療革蘭氏陰性菌感染困難的原因之一。如果我們看一下常見的革蘭氏陰性菌表面的常見教科書圖，就會清楚地看到“不對稱"發(fā)生的位置（圖4）。6

圖4：革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)6

由于革蘭氏陰性菌外膜外葉由LPS組成，而內(nèi)葉由磷脂 （PL） 組成，因此會發(fā)生不對稱性。7如果外葉中聚集了足夠的磷脂，則細(xì)胞有專門的方法來重建不對稱性；包括“漂浮"在新的LPS分子中。8內(nèi)毒素作為單一分子實(shí)體的長期定義包括其形成這種不對稱屏障的獨(dú)-特能力。因此，磷脂和LPS作為單獨(dú)的革蘭氏陰性菌外膜（圖3）的比例是一個重要的屬性。   

4.對比成分

有時，通過描述它不是什么而不是它是什么來定義某物更容易。內(nèi)毒素不包括其他膜相關(guān)分子。它是六種無法通過其他方式檢測到的細(xì)菌殘留物的質(zhì)量或分析標(biāo)志物，因此是制藥生產(chǎn)中的關(guān)鍵質(zhì)量屬性。一種與LPS共享革蘭氏陰性表面的革蘭氏陰性菌外膜成分類型是“孔蛋白"。孔蛋白是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，通常以三聚體形式存在，可調(diào)節(jié)水、溶質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞的通道。 

圖5：反硝化菌胞外表面的高分辨率分析。
A） 膜區(qū)域密集排列著孔蛋白三聚體。
B） 在高分辨率下，子結(jié)構(gòu)在單個三聚體上可見。9

革蘭氏陰性菌外膜的概念最近發(fā)生了變化，因?yàn)?/span>對活細(xì)菌的原子力顯微鏡（AFM） 研究發(fā)現(xiàn)了主導(dǎo)革蘭氏陰性菌表面的孔（圖5）。9這些編織的蛋白質(zhì)鏈形成空心的“管"，從表面向下延伸穿過外膜并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)（圖6D和E）。LPS通過基于鱟的測試提醒制造商注意革蘭氏陰性菌的存在；然而，孔蛋白目前還無法被檢測到。 

圖6：革蘭氏陰性菌外膜9中孔蛋白的天然超分子組裝的原子模型

使用原子力顯微鏡（AFM），Oestreicher等人。10研究了來自大腸桿菌和類球紅細(xì)菌的兩種典型革蘭氏陰性細(xì)菌結(jié)構(gòu)，并指出：“我們的研究清楚地表明，這兩種類型的細(xì)胞都有一個外表面，該外表面覆蓋著類似于分枝桿菌的納米大小的孔網(wǎng)絡(luò)。" 與LPS一樣，孔蛋白是獨(dú)立的持久結(jié)構(gòu)，具有免疫反應(yīng)性且難以破壞。“孔蛋白是極其堅(jiān)固的蛋白質(zhì)，可以在70°C的5M鹽酸胍或2%SDS存在的情況下可以抵抗變性。" 11鑒于孔蛋白本質(zhì)上具有免疫原性，因此應(yīng)該引起人們的興趣。12,13 

雖然它不會改變LPS作為強(qiáng)效污染物的作用，但它清楚地表明LPS并不代表整個革蘭氏陰性菌表面，其革蘭氏陰性菌外膜而是由幾種離散物質(zhì)組成。 

三、總結(jié)

內(nèi)毒素的詳細(xì)定義支持純化LPS作為標(biāo)準(zhǔn)化雜質(zhì)（RSE/CSE）的歷史和持續(xù)使用：

（a）內(nèi)毒素是一種具有特殊組裝的獨(dú)-特結(jié)構(gòu)（九個酶促步驟）；

（b）后生動物對LPS的反應(yīng)（通過TLR4）的特異性與其他反應(yīng)（例如激活TLR2 的孔蛋白或激活TLR5的鞭毛）是分開的；

（c）它包括內(nèi)毒素在產(chǎn)生和維持革蘭氏陰性菌外膜與磷脂成比例的不對稱性方面的作用

（d）它作為與其他外膜結(jié)構(gòu)分開和相鄰的單一結(jié)構(gòu)存在，在結(jié)構(gòu)、功能和免疫反應(yīng)（TLR激活）方面提供了對比。

應(yīng)努力開發(fā)新的測試方法來檢測重要的非LPS膜成分。這形成了一個關(guān)鍵的區(qū)別。與其設(shè)計(jì)一種由未純化的“細(xì)胞壁"成分組成且只能檢測到內(nèi)毒素的“天然內(nèi)毒素"，不如設(shè)計(jì)一種由未純化的“細(xì)胞壁"成分組成的“天然內(nèi)毒素"，單個成分（內(nèi)毒素、磷脂、孔蛋白、鞭毛蛋白等）應(yīng)該有自己的檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)，作為擴(kuò)大微生物污染控制能力。這將提供必要的冗余，而目前檢測亞細(xì)胞革蘭氏陰性細(xì)菌假象的全部權(quán)重都落在了內(nèi)毒素上。

雜質(zhì)測試的適當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)是分析測試的重要組成部分。根據(jù)USP <11>，標(biāo)記為“天然內(nèi)毒素"的雜質(zhì)混合物不是內(nèi)毒素，而是可能含有內(nèi)毒素、蛋白質(zhì)、磷脂、核酸和孔蛋白的混合物。今天基于鱟的測試是針對內(nèi)毒素的，而不是針對非內(nèi)毒素的細(xì)胞壁或細(xì)胞質(zhì)成分；這種特異性在鱟C因子和哺乳動物TLR4檢測架構(gòu)中都是固有的。內(nèi)毒素的定義是一個跨學(xué)科的定義，不能隨便重新定義。 

參考文獻(xiàn)

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11. Koebnik R, Locher KP, Van Gelder P. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell, Mol Microbiol. 2000 Jul;37(2):239-53.

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